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趙新燕

（聊城萬合工業制造有限公司，山東 聊城252022）

石杉堿甲(Huperzine A)是從石杉科植物千層塔[Huperziaserrata(Thumb.)Trev(又名蛇足石杉)]中分離得到的生物堿。它是一種強效、低毒的可逆性乙酰膽堿酯酶抑制劑^[1-3]，可用來治療重癥肌無力、跌打損傷和老年癡呆等癥^[4-5]。石杉堿甲片劑已通過衛生部審批，在國內出售并部分出口國外^[6]。

石杉堿甲治療指數很高^[7-9]，但在天然產物中的含量很低。傳統的提取工藝是將生藥通過溶劑萃取，上柱層析分離，重結晶等工序。所要求的技術含量高，要經過多次層析，反復重結晶，才能達到較高純度，產量低，條件不易控制，周期長，成本高。本文采用制備型高效液相色譜分離了石杉堿甲，分離工藝簡單，提取率高，所得石杉堿甲質量分數較高（90%以上），為進一步利用制備型高效液相色譜法工業規模生產石杉堿甲提供了實驗依據。

1  實驗部分

1.1  儀器

高效液相色譜儀含GLP3250泵，可更換泵頭兩個（250ml）,GLP色譜工作軟件，UC-3292檢測器；超聲清洗機，PH測定儀。

1.2  試劑與試藥

氯仿，甲醇，氨水，硫酸，氫氧化鈉，純水（均為分析純）；石杉堿甲對照品（99.1%含量）；千層塔來源于重慶，經鑒定符合中華人們共和國藥典（2010版）規定。

1.3  色譜條件

分析條件：色譜柱（ID4.6×250mm，C18,粒徑5μm）；流動相：甲醇—水（85：15）；流速：1ml/min；檢測波長：231.3nm；進樣體積10μl。

制備條件：色譜柱（ID63×700mm，Diamonsil C18,粒徑25~40μm）；流動相：氯仿—甲醇—氨水（840：24:1.2）；流速：40ml/min；檢測波長：311nm；進樣體積5ml。

1.4  樣品的處理

取藥材粉碎，過20目篩，取干燥的千層塔粗粉1.6kg，加入10倍體積的PH為1的硫酸溶液，浸泡一段時間12小時，超生浸提幾分鐘，提取幾次，合并酸液；加氫氧化鈉溶液調PH至9，再加氯仿反復提取，并濃縮至膏。

1.5  石杉堿甲的制備

將按照1.4節方法制備的石杉堿甲固體提取物用制備色譜的流動相配制成體積為10mL的溶液，用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾，作為制備液。在1.3節制備色譜條件下開機，待基線穩定后進樣，收集相應餾分，經蒸發濃縮，結晶即可，得石杉堿甲晶體。

1.6  制備樣品的質量分數測定

精密稱取按照1.5節制得的石杉堿甲2mg，用分析色譜流動相定容于10mL容量瓶中。按照石杉堿甲含量測定方法^[10]對所制得的樣品進行石杉堿甲純度檢測,符合質量要求。

2  結果與討論

2.1  流速對分離石杉堿甲的影響

將分析型液相色譜按比例擴大為制備型液相色譜時，盡可能使制備柱的固定相類型、溶劑組分等方面與分析柱保持一致，通常柱長保持大體相同，以增加柱徑來達到更大的柱容量，這樣，只考慮流速問題，可以從下面關系近似得到最大流速：

制備柱流速=×分析柱流速

根據石杉堿甲制備條件中流速大小^[11],結合上式，計算得出大流速為79.38 ml/min。

稱取粉碎干燥的千層塔粗粉1.6kg（共7份），按照1.4和1.5節操作，以氯仿—甲醇—氨水（840：24:1.2）為流動相，考察不同流速對石杉堿甲分離效果的影響，結果見表1。

表1可知：隨著流速的增大，石杉堿甲的保留時間逐漸減小，分離度降低，柱壓升高；隨著流速減小，保留時間延長，分離度增大，但流速太小時，保留時間過長，且色譜峰變寬；流速的變化對石杉堿甲純度的影響不是很大，所以為了縮短分離時間，且保持良好的分離度，選擇流動相的流速為40ml/min。

2.2  進樣質量濃度對分離石杉堿甲的影響

分別稱取粉碎、過篩、干燥的千層塔粗粉1000、1200、1400、1600、1800g，按照1.4和1.5節進行操作，考察了進樣質量濃度對分離石杉堿甲的影響，結果見表2。

表1  流動相的流速對分離石杉堿甲的影響

由表2可知：隨著進樣質量濃度增大，保留時間逐漸增大，分離度降低，洗脫時間延長，所得石杉堿甲的質量分數降低；進樣質量濃度低時分離度較高，洗脫時間較短，所得石杉堿甲的質量分數較高，但生產效率下降。為保證所制石杉堿甲既有較高的質量分數，又有較高的生產效率，選擇進樣質量濃度為160g(生藥材)/mL。

2.3  進樣量體積對分離石杉堿甲的影響

稱取粉碎、過篩、干燥的千層塔粗粉1600g（共6份），按照1.4節進行操作，得6份石杉堿甲固體提取物，分別用制備色譜條件中的流動相配置成體積為2、3、4、5、6、7ml的制備樣品溶液，用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾，得制備液。按1.3節制備色譜條件進行純化分離，考察了進樣質量體積對分離石杉堿甲的影響，結果見表3。

表2  進樣質量濃度對分離石杉堿甲的影響

表3  進樣量體積對分離石杉堿甲的影響

由表3可知：隨著進樣體積增大，石杉堿甲質量分數先增大又減小，分離度先增大后減小，保留時間逐漸增大，當進樣體積大于7mL后，色譜分辨率降低，洗脫時間延長，所得冬凌草甲素的質量分數降低。進樣體積不能太小，否則色譜分辨率太低，冬凌草甲素的質量分數降低。綜合考慮，要分離制得質量分數高的產品，進樣體積以5mL較好。

2.4  石杉堿甲質量分數測量結果

按照上述2.1-2.3節確定的條件分離制備了8批石杉堿甲樣品，按照1.6節條件測定其質量分數，結果見表4，表中數據均為3次測定結果的算術平均值。

表4  石杉堿甲質量分數的測定結果

由表4可知，采用制備型高效液相色譜法所制得的石杉堿甲的質量分數較高，均能達到Huperzine A的純度大于90%的技術要求。

3  結論

我們用制備型高效液相色譜法制備分離石杉堿甲。1.6kg千層塔可以得到近320mg的Huperzine A，重復性好，產品純度達到了技術要求。本方法成本低，可為工業化生產工藝提供參考。

參考文獻

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[11]  楊明，姚志偉，趙毅民.HPLC法制備石杉堿甲[J].解放軍藥學學報，2003,19（5）：352.